基于肠道菌群探讨中药的活性成分及效应物质发现

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原标题:基于肠道菌群探讨中药的活性成分及效应物质发现

摘要:随着现代慢性复杂性疾病发病率的攀升以及中医药在治疗慢性病方面的优势日益凸显,中药的国内外地位与日俱增。而中药活性成分、效应物质及相应作用机制的未知性极大限制了中药的临床接受度与国际化进程。发现直接关切中药药效的活性成分及效应物质是中药研究的关键科学问题之一。在回顾目前中药活性成分发现模式的基础上,跟踪国际研究前沿,结合中药成分特征,依据大多数中药通过口服给药的特点,结合课题组相关研究基础,探讨基于肠道微生态的中药活性成分与效应物质发现研究模式,以期为中药新药研发及作用机制研究等方面提供新思路,助力中药现代化与国际化。

中医药是一个伟大的宝库,以青蒿素、三氧化二砷为代表的具有显著临床生物活性的中药成分的发现不仅挽救了无数生命,也从侧面反映了中药这个宝库珍贵的挖掘价值。然而,中医药是非常复杂的系统体系,可体现在传统理论的模糊性、临床辨证的灵活性、物质基础的复杂性以及作用机制的网络性上。要科学地挖掘与应用中药,必须先深入研究中药的作用物质基础及其作用机制。同时,国务院、国家科技部、国家中医药管理局制定的《“十三五”中医药科技创新专项规划》《中医药发展战略规划纲要(2016—2030年)》等一系列文件提出要加强构建中药活性成分发现、中药复方药效物质基础及其相关物质辨识的关键技术,并探索适合中药特点的新药开发新模式。因此,发现直接关切药效的中药活性成分及效应物质不仅具有重要科学意义,也具有推动中医药发展的战略意义。

近年来,肠道菌群逐渐成为国际上一个重要研究热点,课题组在此方面也进行了一系列有益探索。研究表明,中药口服后会不可避免地与肠道菌群发生相互作用,并且这种相互作用会影响中药的成分结构以及相应的药效[1] 。基于此,课题组在回顾目前中药活性成分发现模式的基础上,跟踪国际研究前沿,结合中药成分特征,依据大多数中药通过口服给药的特点,综合笔者相关研究基础,探讨基于肠道菌群的中药活性成分及效应物质发现模式,总结该模式的现实及潜在意义,助力中医药的现代化与国际化。

1中药活性成分与效应物质的相关背景

临床上,绝大多数中药通过口服形式给药。中药口服后,部分成分能直接被胃肠道吸收进入血液并移行至靶器官发挥药效作用,部分成分先在胃肠道及肝脏经过代谢后再移行至靶器官发挥药效作用,这些存在于中药中并能直接或间接发挥药理作用的成分称为有效成分或活性成分[2]。既无直接药理活性也无间接药理活性的成分叫无效成分。效应物质是人体内能直接产生生物学效应的化学效应物质[2]。对于中药活性成分而言,一部分活性成分必须经过转化或代谢为效应物质后才具有药理活性,这部分活性成分类似于前药(prodrug)的概念。显然,从物质的种类数量来看,活性成分与效应物质属于交集关系。从语义背景上讲,活性成分更强调的是中药本身含有的成分,而效应物质强调的是中药活性成分在体内处于活性结构状态下的物质。

中药活性成分及效应物质发现在指导新药研发及中药作用机制阐释等方面具有十分重要的科学意义。从20 世纪初我国药理学家陈克恢先生发现麻黄碱的药理作用以来,经典的植化分离、单体成分活性评价及作用机制研究模式取得了丰硕的成果,筛选出了一大批具有良好临床生物活性的成分如青蒿素、紫杉醇、羟基红花黄色素A 等。然而,这种传统手段具有相当大的盲目性与偶然性。20 世纪末到21 世纪初,得益于材料学、色谱及成分检测技术的发展,出现了药理活性跟踪筛选模式、血清药物化学模式、生物膜亲和色谱筛选模式等活性成分发现模式[3] 。相对于经典的植化分离模式,这些活性成分发现模式一方面排除了筛选的盲目性与偶然性,另一方面也具有较高的筛选通量及筛选的目的性。除上述基于实证的活性成分发现模式之外,随着计算机技术的发展,基于计算机虚拟高通量筛选技术应运而生。该技术的应用前提是中药小分子化合物及作用靶点结构已知,但由于虚拟结果与真实受体- 配体相互作用可能存在差异,故而通常结合其他实验对结果进行确证[4] 。上述研究模式各有优势,极大地满足了中药活性成分筛选的需求,但未能考虑到肠道菌群与中药之间的相互作用。

2基于肠道菌群的中药活性成分及效应物质发现模式的提出

肠道菌群是一个以共生方式居住在人体胃肠道的复杂微生物群落。人类很早就认识到肠道菌群的存在,然而受制于培养条件、检测技术等的限制,人类对肠道菌群的具体功能及作用认识不够深入。随着基因测序技术、代谢组学检测技术等的飞速发展,肠道菌群成为了生命科学领域一个重要的研究热点。在生理状态下,肠道菌群一方面可通过复杂的动态调控网络与宿主相互作用,调节宿主的代谢、免疫、肠道结构完整性等[5-7] ;另一方面还可以通过刺激机体产生抗菌物质和竞争性的争夺营养物质、挤占贴附位点等方式抵御外来病原菌的入侵[8] 。肠道菌群的重要性不仅与维持宿主的体内稳态有关,而且还与宿主的一系列疾病相关。临床以及动物实验已经证明肠道菌群的紊乱与帕金森病、高血压、结肠炎、2 型糖尿病,非酒精性脂肪肝等有着密切的关联[9] 。

由于中药往往包含不同结构类型的化合物,这些化合物中很多极性较大,如植物多酚类成分。这些大极性的化合物口服生物利用度通常很低,如植物多酚的口服生物利用度往往小于[10] 。因此,中药口服后,一部分直接被吸收,而另一部分生物利用度低的成分可以很容易地通过小肠并到达大肠,大肠由于富含肠道微生物,未被吸收的成分会不可避免地与肠道菌群直接接触。进而,肠道菌群可以与未被吸收的中药成分发生相互作用:一方面,肠道菌群会转化中药化学成分,另一方面,中药可以调控肠道菌群的组成和代谢(图1 )。大量研究表明,中药的药效发挥与中药和肠道菌群的相互作用有密切关联。例如,长庚大学赖信志教授课题组在Gut 杂志发表论文证明了肠道菌群与冬虫夏草多糖发挥治疗肥胖的作用具有因果关系[11] 。由此可见,肠道菌群是中药的直接作用靶点,同时也是研究中药作用机制不可忽视的一部分。

2.1肠道菌群可转化中药原型成分并改变其活性

中药口服进入胃肠道后,会与肠道菌群相互接触,尤其是口服生物利用度较低的成分。肠道菌群可以合成一系列具有催化代谢肠道内容物作用的酶。通过改变药物成分结构,这些酶具有活化、灭活或者重活化药物的能力[12] 。因为肠道菌群强大的代谢活性,其被认为是一个与肝脏具有相同代谢潜能的代谢器官[13] 。肝脏和肠道菌群对药物的代谢显著不同,肝脏代谢通常产生更高极性以及更高相对分子质量的代谢物,而肠道菌群通常产生极性和相对分子质量更低的代谢物[14] 。肠道菌群转化药物的反应包括水解、氧化、还原、异构、重排、酯化、缩合等[1] 。在被肠道菌群转化后,中药成分可能表现出不同强度的生物活性。例如,芦丁、橙皮苷、柚皮苷、枸橘苷等黄酮类化合物可以被α- 鼠李糖苷酶、β- 葡萄糖苷酶、内-β- 葡萄糖苷酶等转化为相应的苷元,这些苷元相对于前体物质具有更强的抗血小板聚集作用[15] 。肠道菌群也可以活化一些前体药物。甘草酸是具有低生物活性的糖基化皂苷,并且通过ip 不能够观察到肝保护活性[16] 。但其可以经过肠道菌群水解为更容易被吸收的18β- 甘草次酸,并且通过ip 表现出肝保护活性[17] 。另外,相对于母体化合物,肠道菌群转化后的中药成分可表现出更低的分子极性以及更高的生物利用度。例如,肠道菌群可以通过去甲基化、脱羟基化等作用将小檗碱(berberine )转化为不同的物质,包括二氢小檗碱、小檗红碱、去亚甲基小檗碱、药根碱等(图2 )。这些物质有的具有更好的亲脂性,相对于小檗碱也更容易被吸收[18] 。可见,肠道菌群可以转化中药成分,并且这些转化产物相对于母体化合物具有不同的分子活性及功能。

2.2中药可影响肠道菌群的代谢及功能分子的合成

除代谢并转化中药成分以外,肠道菌群自身也可以合成一系列具有重要生物学功能的代谢产物,这些代谢物被称为功能分子。自从弗莱明从青霉菌中发现青霉素以来,微生物一直是人们寻找具有生物活性的天然产物的重要来源。然而受制于严格的培养条件及相关检测技术,肠道菌群代谢物在很长一段时间内被忽略。近年来,随着肠道菌分离培养技术、基因检测技术、代谢物检测技术等的发展,研究人员重新聚焦于长久以来被遗忘的肠道菌群及其代谢产物。通过无菌动物与普通动物比较实验、功能基因组学分析、代谢组学分析等实验,研究人员发现这些代谢产物具有广泛的生理功能,并且这些物质有望开发成新药[19] 。例如,正常的肠道菌群 可分泌一系列对病原菌具有抑制作用的代谢物如抗菌素、抗菌肽等,这些物质可开发为新型的抗菌药物[20] 。除此之外,研究发现肠道菌群的代谢物具有免疫调节、抗炎、营养、调节代谢、调节神经冲动等作用,这些功能分子有望开发为免疫调节药物、抗炎药物、减肥药物等[19] 。目前发现的这些功能分子包括短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)、ruminococcinA、plantaricins、tryptamine、polysaccharideA等[21]。这些功能分子的发现极大地促进了研究人员对肠道菌群相关活性天然产物的研究与开发,并且基于肠道菌群的功能分子挖掘已经成为了当前生命科学领域内一个重要的前沿与热点[22-23]。

中药口服进入胃肠道后,可以影响肠道菌群的代谢,使肠道菌群次生代谢产物及功能分子的种类和含量发生改变。例如,羟基红花黄色素A (hydroxysaffloweryellow A ,HSYA )的口服生物利用度较低(1.2% )[24] ,单纯从HSYA 的口服吸收入血量较难解释其生物活性。通过给予肥胖小鼠ig HSYA ,发现HSYA 可以增加肠道中乙酸、丙酸、丁酸的含量,并且这一过程与产SCFAs 的菌(如Butyricimonas 和Alloprevotella )的增加有关[25] 。考虑到SCFAs 可以调控机体的多种功能,包括与肥胖有关的炎症、氧化压力等,同时还对一些疾病如糖尿病、肥胖等具有改善作用[26] 。由此推测,HSYA 可影响功能分子SCFAs 的合成,同时SCFAs 也是HSYA 起效的效应物质。

3基于肠道菌群的中药活性成分及效应物质发现研究思路

从机体的肠道吸收来看,中药口服后,机体吸收的可能的药效物质包括:(1 )中药原型成分;(2 )来源于中药且被肠道菌群转化的物质,如人参皂苷转化而来的compoundK 等;(3 )由肠道菌群全新合成的自身代谢物物质,如肠道菌群发酵食物中纤维得到的SCFAs (图1 )。例如,口服小檗碱会在肠道菌群的作用下产生二氢小檗碱等肠道菌群转化的产物,同时小檗碱也可以改变肠道菌群的自身代谢功能,使肠道SCFAs 如乙酸、丙酸、丁酸等含量增加(图2 )。这3 种类型的代谢物对于研究中药与肠道菌群作用于机体的机制有十分重要的意义。

由于肠道内容物复杂,包含食物成分、食物代谢后成分、宿主分泌物质、肠道菌群代谢物等物质,因此,如何对活性成分或效应物质进行有效初步筛选是整个流程最重要的一步。许多组学技术,如高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱的代谢组学技术由于前期提取方法、检测参数等原因不能完全检测 出基质中的代谢物。近年来,多组学联合分析是一个研究趋势。相对于仅仅分析肠道菌群或代谢物得到单一的数据不同,多维多息的检测得到的数据可以在另一个维度上推测某一种检测方法遗漏的信息[27] 。例如,宏基因组学由于能够推测代谢物的变化,与代谢组学结合进行靶向代谢组学检测则能更精准地对代谢产物进行解析。在中医药以外的其他领域,采用这种整合的方法已经成功鉴定出有益或者有害的肠道菌或者代谢物[28-29] 。这些多组学整合对研究中药与肠道菌群和宿主之间关系有十分重要的借鉴意义。

肠道内的活性成分或效应物质首先被机体吸收进入血液,再输送至靶器官。由于吸收进入体内的物质并不一定是活性成分或效应物质,因此,需要进一步对这些成分进行药效学验证。据此,笔者提出基于肠道菌群的中药活性成分及效应物质发现研究思路(图3 )。实际实践中,可根据具体实验条件及预知知识做灵活变动。例如,菌群结构和功能表征方面,可结合功能宏基因组学等技术首先对差异菌群次生代谢产物做出预测,再进行靶向代谢组学分析;也可先进行非靶向代谢组学检测,再进行靶向代谢组学检测。

4研究案例

小檗碱是具有降血糖、改善胰岛素抵抗等作用的异喹啉类生物碱,近年来广泛用于肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢性疾病的防治,但口服生物利用度较低。在肥胖和2 型糖尿病患者的外周血中,支链 氨基酸(branched-chainamino acids,BCAAs)水平与胰岛素抵抗的发生呈显著正相关[30]。Pedersen等[31] 发现肠道中Prevotella copri 和Bacteroides vulgatus 参与BCAAs 的合成,提示胰岛素抵抗患者血清BCAAs 水平的大幅升高可能与肠道菌群的变化存在密切的关系。研究发现,小檗碱可以改善高脂饮食小鼠的胰岛素抵抗作用,并且该过程伴随着小鼠肠道菌群的改变,尤其是产BCAAs 菌如Streptococcus 和Prevotella 的减少(图4 )。通过PICRUSt (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction ofUnobserved States )预测分析发现,小檗碱处理后肠道菌群中参于BCAAs 合成的基因减少而参与BCAAs 分解和转运的基因上调。对小鼠血清靶向检测显示小檗碱处理后,血清缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及总BCAAs 含量显著降低。同时,Westernblotting 显示小檗碱可以通过逆转高脂饮食引起的支链α- 酮酸脱氢酶激酶(branched-chain α-ketoacid dehydrogenase kinase ,BCKDK )和p-BCKDHA (BCKD E1α 亚基)表达变化促进BCAAs 在肝脏及附睾脂肪组织(eWAT )的代谢。在此基础上,单中心小样本临床试验进一步表明小檗碱能降低外周血中BCAAs 水平[32] 。该研究表明,难吸收入血的小檗碱可通过调节肠道菌群的BCAAs 合成代谢改善胰岛素抵抗,同时BCAAs 为小檗碱的部分效应物质。

5潜在科学意义

5.1从肠道菌群切入